Se baseia em reações antígeno-anticorpo detectáveis através de reações enzimáticas. As enzimas mais comumente utilizadas nestas provas é a peroxidase e fosfatases. A peroxidase catalisa a reação de desdobramento da água oxigenada (H₂O₂) em H₂O mais O₂.

O teste Elisa direto é caracterizado pelo antígeno ligado na placa e um anticorpo secundário já conjugado com um emissor de cor é colocado diretamente sobre o alvo. A sensibilidade deste tipo de Elisa é mais baixa e quase não é usado.

A reação específica antígeno-anticorpo é detectada pelo desenvolvimento de cor que acontece pela reação de redução de um cromógeno incolor em consequência da reação catalisada por uma proteína previamente conjugada ao antígeno detector.

No teste de Elisa, direto ou indireto, é necessário inicialmente fixar o anticorpo a uma superfície sólida o qual o antígeno contido na amostra irá se ligar. O antígeno por sua vez estará ligado a um marcador enzimático.