A reação envolve a utilização dos cinco deoxinucleotídeos (dNTPs) do DNA (A-T-C-U-G), sequências de iniciadores específicos (ou primers), uma polimerase de DNA termolábil e o DNA molde (amostra).

Em resumo, a técnica consiste basicamente em três etapas: a dupla fita é desnaturada pelo calor (~95°C); em seguida, cada iniciador (primer – senso e anti-senso) anela a uma das fitas simples do DNA; finalizando o ciclo pelo processo de extensão e polimerização da fita, a partir da adição de nucleotídeos e ação da DNA polimerase termoestável.

As sondas fluorescentes utilizadas são anticorpos monoclonais específicos para cada tipo de primer utilizado.

Assim como os ribossomos 70S ou 80S, esta técnica de PCR pode também ser usada para sintetizar RNA ou proteínas por meio da transcrição reversa.

Uma sequência coerente de etapas envolveria a desnaturação do DNA genômico (95°C, 30s); anelamento dos primers no DNA genômico (40-65°C, 30s), seguido da síntese do DNA pela polimerase termolábil (72°C, 2-5 min).