São exemplos de substâncias que podem ser identificadas, separadas ou isoladas, por HPLC: metabólitos, aminoácidos, peptídeos, proteínas e substâncias farmacologicamente ativas.

Esta técnica é bastante utilizada para análises de compostos instáveis termicamente ou não voláteis, ou quando a cromatografia a gás não é recomendada ou não pode ser utilizada.

Na técnica de HPLC, a separação dos constituintes de uma mistura ocorre pela migração da amostra através de uma fase móvel, por intermédio de um fluido também chamado de fase estacionária.

Tem por objetivo separar individualmente constituintes de uma mistura de substâncias, para fins de identificação, quantificação ou isolamento da substância pura para fins diversos.