Os melhores resultados de sequenciamento são obtidos com peptídeos de 2.5kDa ou menos.

Para a realização do sequenciamento, as proteínas são retiradas do gel e submetidas à proteólise.

Na espectometria de massa em tandem, os peptídeos são fragmentados nas ligações peptídicas.

Alguns peptídeos geram informações para uma sequência completa, enquanto a maioria gera sequências parciais de 4 ou 5 aminoácidos.

As pequenas sequências obtidas nas análises de sequenciamento são pouco informativas e apenas podem ser utilizadas se estiverem presentes de forma abundante na amostra, independente do fato de estarem ou não presentes no banco de dados utilizado.