O pirosequenciamento é uma técnica de seqüenciamento baseada na detecção de pirofostafo (PPi) liberado durante a síntese de DNA.

Este PPi liberado é convertido em uma molécula de ATP pela enzima ATP Sulfurilase. A enzima Luciferase utiliza essa molécula de ATP para oxidar Luciferina e produzir fóton de luz.

Os fótons de luz produzidos são detectados por aparelhos e a quantidade de luz transmitida é proporcional ao número de nucleotídeos incorporados.

Esta técnica depende de clonagem dos genes de interesse em vetores pois a reação de PCR não é suficiente para amplificar a quantidade de DNA necessária para a técnica.

O pirosequenciamento oferece uma técnica capaz de detectar mais facilmente a presença de alelos heterozigotos, o que na técnica comum é dificultada devido à reação de PCR para seqüenciamento.