Culturas de células primárias são produzidas a partir de células retiradas de um tecido por processos de desagregação mecânica ou enzimática, ou seja, são formadas a partir de células que sobrevivem aos processos de desagregação, aderem-se ao substrato da garrafa de cultura (ou mantêm-se em suspensão) e proliferam.

Os meios de cultura completos devem conter antibióticos como estreptomicina e penicilina apenas no momento do início do cultivo. Após a aderência das células, na primeira troca de meio, os antibióticos não devem ser adicionados ao meio, pois atrasam o crescimento das células.

Para se iniciar uma cultura de tecidos, as células animais, obtidas de biopsias de diferentes tecidos, podem ser cultivadas a partir de pequenos fragmentos obtidos mecanicamente (explante) ou dissociadas com a utilização de enzimas como a colagenase (dissociação enzimática). Ambas as técnicas permitem o estabelecimento de culturas primárias, sendo que o cultivo por explante promove um crescimento mais rápido que a dissociação enzimática

Após o estabelecimento da cultura primária, as células se multiplicam e cobrem a superfície da garrafa de cultura, formando várias camadas de células sobrepostas. Caso se deseje expandir a cultura, faz-se o repique; por meio da ação da tripsina, as células são soltas da parede da garrafa e divididas para outras garrafas

Após o estabelecimento de uma cultura primária, as células podem replicar-se e ser repicadas infinitamente, contanto que sejam respeitadas as condições de cultivo – como temperatura, nutrientes e cuidados com contaminações por microrganismos.