De uma forma geral, o teste baseia-se em uma reação química em que as proteínas do anticorpo permitem a formação de fragmentos moleculares, chamados de fluorocromos, por mecanismos de hidrólise.

Consiste na adição de espécies surfactantes de elevado rendimento quântico de fluorescência. Para o processo de excitação do fluocromo (marcador) deve-se utilizar luz com comprimento de onda superior ao máximo de emissão.

O método baseia-se na conjugação do fluorocromo com o anticorpo. Os fluorocromos são moléculas com cadeia reticulada e, raramente, apresentam insaturações. São exemplos: lisamina-rodamina B; vermelho Texas; e, ficoeritrina.

O teste de imunofluorescência direta é usado na pesquisa e localização de antígenos em células ou tecidos. Sua principal aplicação ocorre na imunocitoquímica, na demonstração de vários antígenos de células e tecidos, principalmente, nas doenças imunológicas renais e de pele.

A análise é realizada por quimioluminescência, usando cubetas com duas faces polidas. Para permitir a detecção, o material genético das células liga-se reversivelmente aos fluorocromos, formando fragmentos conjugados radicalares capazes de fluorescer na região do ultravioleta (200-800 nm).