Quando as células em cultura estiverem na fase lag do crescimento deve ser adicionado meio de cultivo para promover a diluição celular.

Para a verificação da necessidade de subcultivo das linhagens em suspensão, as células devem ser contadas para o cálculo de sua concentração. Verificando-se uma alta densidade celular, deve-se diluir as culturas para uma concentração de 1 × 10⁵ células/mL (para aquelas com taxa de crescimento lenta) ou 2 × 10⁴ células/mL (para aquelas com taxa de crescimento rápida).

O subcultivo das células em suspensão pode ser feito por meio da retirada de parte da cultura presente no frasco, seguida da adição da quantidade necessária de meio de cultura novo, pré-aquecido, de forma que a concentração celular desejada seja atingida, ou com a retirada de uma fração das células e da passagem para novo frasco contendo volume de meio novo necessário para atingir a concentração desejada.

O cultivo inadequado das células em suspensão pode ocorrer devido à superpopulação, uma vez que inibe a proliferação celular.

A maioria das células que crescem em suspensão tem tendência em formar grumos. A fim de promover a separação das células basta ser feita leve agitação com o auxílio de pipeta ou por leve agitação do frasco de cultura.