Reação de PCR com amplificação de um fragmento utilizando um par de iniciadores (primeiro par de iniciadores), seguida por nova reação de PCR dos produtos amplificados com amplificação de sequência interna utilizando um segundo par de iniciadores mais internos (segundo par de iniciadores).

Reação é composta de duas partes, a transcrição reversa e a amplificação propriamente dita. Seu principal diferencial é que, na verdade, a reação não parte de um molde de DNA diretamente extraído da amostra. A amostra fornece o RNA, que é convertido em cDNA.

Mais de um segmento genômico é amplificado numa única reação, cada um com seu par específico de iniciadores. Esta técnica pode simplificar alguns experimentos, como a investigação de paternidade, onde vários marcadores genômicos devem ser analisados.

Além do DNA molde, é adicionado à reação um outro trecho de DNA, de seqüência, tamanho e concentração conhecidos (controle), cujas extremidades são complementares também aos iniciadores que irão amplificar a seqüência-alvo. O resultado é a amplificação de dois trechos de DNA: a de interesse e a controle.

A reação associa a metodologia de PCR a um sistema de detecção e quantificação de fluorescência produzida entre os ciclos de amplificação. Assim, a técnica permite a amplificação, a detecção e a quantificação em uma única etapa.