O procedimento de coloração consiste em aplicar em sequência um corante primário (cristal de violeta), descorante (álcool ou álcool-acetona) e solução de iodo (lugol).

A solução de iodo (lugol) funciona como mordente, permitindo que o corante fique aderido ao objeto a ser corado.

A etapa de descoloração é bastante importante, pois um tempo excessivo nesta etapa pode, eventualmente, remover a coloração primária até mesmo dos organismos Gram-positivos, causando a sua identificação incorreta.

As reações de coloração de Gram são baseadas nas diferenças químicas da estrutura da parede celular bacteriana, sendo a parede das células Gram-negativas quimicamente mais complexas do que as paredes das células Gram-positivas.

Como formas de garantir a qualidade da coloração, os reativos de Gram não deverão ser usados após o limite da data de validade, e as lâminas de controle devem ser usadas para verificar os reativos de coloração e a técnica do profissional.