O corante púrpura e o iodo se combinam no citoplasma de cada bactéria, corando-a de violeta escuro ou púrpura. As bactérias que retêm essa cor após a tentativa de descolori-las com álcool são classificadas como Gram-positivas.

Como as bactérias Gram-negativas são incolores após a lavagem com álcool, elas não são mais visíveis. É por isso que o corante básico safranina é aplicado; ele cora aa bactérias Gram-negativas de rosa.

Uma vez que a coloração púrpura impregna todas as células, ela é denominada coloração primária.

O modo pelo qual diferentes tipos de bactérias reagem de modo distinto à coloração de Gram, se deve, basicamente, por diferenças metabólicas entre bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. As diferenças estruturais em suas paredes celulares não afetam a retenção ou a liberação do corante púrpura e do iodo.

Os corantes como a safranina, que possuem uma cor contrastante com a coloração primária, são denominados contracorantes.