Antes do tratamento com o solvente orgânico, ambos os tipos de bactérias são corados com o cristal de violeta.

Na coloração de Gram, são empregados dois corantes, o cristal de violeta e a safranina, um mordente, que é o lugol, e um solvente orgânico, que usualmente é uma mistura de éter-acetona.

A diferenciação entre Gram positivo e Gram negativo deve-se às diferenças nas proteínas das membranas nucleares dos dois grupos de bactérias.