as novas tecnologias de sequenciamento não podem ser utilizadas nas metodologias de RNA-seq atuais, pois a transcriptase reversa não é compatível com esses novos métodos.

é possível realizar análises e agrupamentos (assemblies) de transcriptomas sem a necessidade de um genoma de referência, o chamado “de novo assembly”.

dentre as métricas para acessar a qualidade de um transcriptoma encontra-se a medida de qualidade de um agrupamento (assembly) que inclui a média do tamanho dos fragmentos, número de fragmentos gerados e N30.

genes de maior tamanho terão menor número de fragmentos/leituras sequenciadas que genes menores, se a expressão do transcrito for a mesma. A expressão dos genes é ajustada pela divisão dos fragmentos sequenciados pelo tamanho do gene, resultando na métrica: fragmentos por kilobase do transcrito por milhões de leituras mapeadas (FPKM).

a expressão gênica varia dentro e entre tecidos, e o RNA-seq mede a expressão com mistura entre tipos celulares. Até o presente momento não é possível realizar RNA-seq com uma única célula, sendo 2x10⁶ o número mínimo recomendado de células.