inicialmente realiza-se um esfregaço fixado em calor que é coberto com um corante básico púrpura, geralmente cristal violeta. Uma vez que a coloração púrpura colore todas as bactérias, ela é denominada coloração primária.

após a coloração primária, depois de um curto período de tempo, o corante púrpura é lavado, e o esfregaço é recoberto com iodo, um mordente. Quando o iodo é lavado, ambas as bactérias gram-positivas e gram-negativas aparecem em cor violeta-escura ou púrpura.

em uma terceira etapa do procedimento, a lâmina é lavada com álcool ou com uma solução de álcool-acetona. Essa solução é um agente descorante, que remove a coloração púrpura das células de algumas espécies, mas não de outras.

na última etapa do procedimento, o álcool é lavado e a lâmina é corada com safranina, um corante básico vermelho. O esfregaço é lavado novamente, seco com papel e examinado microscopicamente.

o corante púrpura e o iodo se combinam no citoplasma de cada bactéria, corando-a de violetaescuro ou púrpura. As bactérias gram-negativas permanecem com a cor de violeta-escuro ou púrpura, enquanto as bactérias gram-positivas não retêm o corante; elas ficam incolores até serem contracoradas com safranina, apresentando assim a coloração cor-de-rosa.