O sangue deve ser colhido por meio de seringa estéril ou de outro tipo de material, após assepsia rigorosa da pele, que deve ser feita primeiro com água e sabão neutro, em seguida com álcool a 70% e, por último, com tintura de iodo a 1%.

O sangue deve ser colhido em frasco estéril contendo meio de cultura e anticoagulante, que não deve ser tóxico para a grande maioria das bactérias como, por exemplo, citrato, fluoreto e oxalato de sódio.

Os meios de cultura mais utilizados no isolamento de bactérias do sangue são caldos de soja com hidrolisado de caseína (TSB) ou infusão de cérebro e coração (BHI). Estes devem ser distribuídos em frascos com tampa de borracha e selados com lacre de metal ou tampa de rosca.

Os frascos de hemocultura devem ser incubados a 370 C, e ser observados diariamente durante sete dias.

Umas das causas mais importantes de erros na interpretação dos resultados de hemocultura é a contaminação do sangue com bactérias da flora normal da pele, devido a assepsia inadequada.