Utiliza-se o produto de um PCR anterior com um par de primers internos ao par utilizado na primeira reação. Essa variação é utilizada para aumentar a sensibilidade e especificidade nos casos em que as amostras utilizadas não são muito boas.

A reação é composta de duas partes, a transcrição reversa e amplificação propriamente dita. Seu diferencial é que a reação não parte de um molde de DNA diretamente extraído da amostra. A amostra fornece RNA que é convertido em cDNA.

A reação associa a metodologia de PCR a um sistema de detecção e quantificação de fluorescência produzida pelos ciclos de amplificação. Desta forma a técnica permite amplificação, a detecção e a quantificação em uma única etapa, com sensibilidade e especificidade.

Além do DNA molde é adicionado um trecho de RNA, de sequência, tamanho e concentração conhecidos, cujas extremidades são complementares também aos iniciadores que irão amplificar a sequência-alvo. Dessa forma aumenta a acurácia do teste.