A penicilina leva a formação de um falso substrato para o bactoprenol, impedindo subsequentemente o transporte de aminoácidos utilizados para a formação de polímeros que vão formar a síntese da parede bacteriana.

O anel β-lactâmico substitui o peptídeo Park, dessa forma impede a agregação dos aminoácidos utilizados para a formação da parede celular da bactéria. Normalmente esse processo é mais efetivo em bactérias gram negativas, principal grupo de atuação das penicilinas.

As penicilinas impedem por acilação a enzima D-alanil-D-alanina transpeptidase interrompendo a síntese e consequentemente a formação adequada da parede bacteriana.

As penicilinas ligam-se com as PLPs ou proteínas ligadoras de penicilinas e dessa forma impedem a síntese de proteínas essenciais a formação da parede bacteriana. A parede mal formada ocasiona a lise da bactéria e assim a sua morte (ação bactericida).

As penicilinas induzem a formação de peptideoglicano que por sua vez leva a formação de polímeros ativadores de autolisinas, ocasionando a lise da bactéria e assim a ruptura de sua parede e o efeito bactericida.