Recomenda-se que o período ideal de coleta da primeira amostra esteja compreendido entre o 3º e o 5º dia de vida do bebê.

Deve ser considerada como uma condição de exceção toda coleta realizada após o 28º dia de vida.

A punção deve ser numa das laterais da região plantar do calcanhar, especificamente em face lateral direita.

O Teste do pezinho detecta precocemente seis doenças congênitas: Fenilcetonúria, Hipotireodismo congênito, Fibrose Cistica, Hiperplasia adrenal congênita, Deficiência de Biotinidase, Doença Falciforme e outras hemoglobinopatias.