Nas mitocôndrias a energia contida nas ligações covalentes das moléculas dos alimentos é utilizada para fosforilar o ADP. Diferentemente da glicose, que é inicialmente convertida em piruvato no citoplasma, os ácidos graxos penetram nas mitocôndrias, onde são quebrados por uma série de enzimas específicas em um processo de degradação denominado β-oxidação.

As mitocôndrias possuem duas membranas – uma externa e outra interna – as quais estabelecem dois compartimentos: o espaço intermembranoso e a matriz mitocondrial. A matriz mitocondrial apresenta várias cópias do DNA mitocondrial, diversos tipos de RNA e o aparato enzimático necessário para as reações do ciclo do ácido cítrico e, ainda, outras reações associadas a sua função.

A membrana interna das mitocôndrias apresenta invaginações na direção da matriz, formando as chamadas cristas mitocondriais, as quais aumentam a superfície interna de membrana. Nesta membrana, localizam-se os componentes da cadeia transportadora de elétrons e o complexo ATP-sintetase.

As mitocôndrias são organelas semiautônomas que se reproduzem por fissão binária. Contêm componentes necessários para a síntese de algumas proteínas e DNA próprio, circular. Com base nestes e em outros aspectos, é plausível que as mitocôndrias tenham evoluído de células procariontes aeróbias fotoautotróficas que tenham estabelecido simbiose com células eucariontes.

As mitocôndrias humanas são de origem materna, pois todas provêm do ovócito fecundado. Na fecundação, após a fusão de membrana entre as duas células gaméticas, as mitocôndrias do espermatozoide são marcadas e destruídas, restando somente aquelas de origem materna. Este tipo de herança uniparental favorece o uso do DNA mitocondrial em estudos sobre a história evolutiva da espécie humana.