O princípio básico da autoclave é baseado na Lei de Boyle, que estabelece uma relação entre pressão, temperatura e volume, sendo que a capacidade de esterilizar se deve à pressão empregada no sistema.

Para atingir as condições ideais de esterilização no interior da câmara, deve-se realizar a desaeração, pois o ar atua como um isolante térmico e dificulta a transmissão da energia por meio do calor.

Para melhor funcionamento da autoclave, a saída da mangueira de drenagem deve ficar imersa em um recipiente fechado com água.

Antes da autoclavação, os materiais precisam ser lavados e enxaguados, mas não é necessário secá-los.

Instrumentos de aço com alto teor de carbono são os mais indicados para esterilização em autoclave, pois oxidam menos e não perdem o fio de corte com a autoclavação.