O calor é o agente esterilizante mais simples, econômico e seguro de que se dispõe, contudo a sensibilidade dos diferentes microrganismos à ação do calor é bastante variada, sendo as formas esporuladas as menos resistentes.

O processo de esterilização empregando vapor saturado sob pressão é realizado em câmara denominada autoclave. Para esse método de esterilização, a condição de referência para esterilização de preparações aquosas é de aquecimento de, no mínimo, 121 °C por, pelo menos, 15 minutos. Combinações distintas de tempo e temperatura podem ser utilizadas, contanto que validadas e que demonstrem a eficácia do processo escolhido.

A esterilização térmica por calor seco é realizada em estufa com distribuição homogênea do calor, que pode ser obtida por circulação forçada de ar. As cepas de Geobacillus stearothermophilus são as mais recomendadas para serem utilizadas como indicador biológico nos processos de validação e monitorização desse método.

A filtração é empregada para esterilização de soluções termossensíveis por remoção física dos microrganismos contaminantes. A filtração para fins de esterilização é, normalmente, realizada com membranas de graduação de tamanho de poro nominal de 0,3 µm, ou menor.

A esterilização pelo gás óxido de etileno é o método de escolha para esterilização de medicamentos que não resistem a altas temperaturas, como no processamento por calor seco ou calor úmido. Esse método é frequentemente utilizado por ser considerado altamente seguro e incapaz de deixar resíduos tóxicos nos materiais tratados.