Como as estruturas celulares têm índices diferentes, dão origem a diferenças de fase entre as ondas luminosas emergentes. Dispositivos colocados na lente condensadora e nas objetivas transformam essas diferenças de fase em diferenças de amplitude, resultando em uma variação na intensidade luminosa percebida pelo contraste claro e escuro.

A luz emitida pela preparação atravessa um pequeno orifício e forma uma imagem bidimensional. A série de imagens de diferentes planos focais é utilizada para reconstruir uma imagem tridimensional do objeto em um computador.

A luz ultravioleta é usada como radiação excitadora nesse tipo de microscopia. Por ter menor comprimento de onda (cerca de 2μm), ela permite localizar constituintes celulares em fases diferentes

O aquecimento de um filamento de tungstênio (cátodo) emite elétrons que são acelerados devido a uma diferença de potencial de 50 a 100kV entre o cátodo e o ânodo. Os elétrons passam por uma placa metálica perfurada com carga positiva, formando diferentes fases no objeto em análise.

Os elétrons são desviados por porções do objeto que contêm átomos de elevado peso molecular. Essas regiões ficam escuras, são eletrodensas. As partes da amostra através das quais os elétrons passam aparecem claras, são eletrolúcidas. Assim, observa-se o material em camadas ou fases.