Na coloração deve-se descorar a lâmina com a mistura álcool-acetona (1:2), até que o solvente escorra incolor.

O Contra-corante tem validade de um ano em temperatura ambiente ou fucsina básica a 0,1% ou 0,2% em água reagente.

No preparo do reagente para a coloração de Gram (modificado por Hucker), o Cristal-Violeta, solução de estoque, deve conter na solução A, 500 mL de álcool etílico a 96%.

Todo o esfregaço, antes de ser submetido à coloração, deverá estar seco (exposto ao ar), sendo fixado com calor brando de (40ºC). A fixação excessiva e o superaquecimento irão distorcer a morfologia celular e a fixação insuficiente permitirá a saída do material durante o processo de coloração, entretanto a lâmina deve estar em temperatura "morna" para iniciar a coloração.

As bactérias Gram-negativas retêm o cristal-violeta e se apresentam com coloração violeta enquanto as Gram-positivas são descoradas pelo álcool-acetona, sendo, portanto, coradas com o corante de fundo (fucsina ou safranina) e se apresentam avermelhadas.