não é necessário realizar a termociclagem, porém o instrumento precisa estar capacitado para registrar os resultados de cada ciclo de amplificação na PCR em tempo real.

embora a PCR em tempo real seja extremamente precisa, ela não pode ser aplicada a estudos de carga viral em amostras biológicas.

a possibilidade de detecção em tempo real se deve à utilização de sondas ligadas à fluoróforos, responsável pela emissão de fluorescência.

não podem ser utilizadas para detecção de vírus que possuem RNA como material genético, uma vez que as sondas e primers se ligam especificamente em moléculas de DNA.

apesar de ser uma técnica avançada, ainda não permite ao usuário a detecção de diferentes agentes virais em uma única reação de PCR em tempo real.