A fixação do material antes do início da coloração pode ser feita por aquecimento suave ou por contato com metanol.

Após o contato com o primeiro corante, não há contato da amostra com agentes fixadores.

Para que a coloração de Gram seja eficaz, a parede celular dos microrganismos deve ser removida na primeira etapa do processo, de forma que os corantes consigam se ligar aos seus alvos no interior das células.

A amostra a ser preparada para coloração por Gram não pode estar em solução salina, devido à interferência que essa solução gera no resultado da coloração.