A reação em cadeia de polimerase é um método de alta especificidade e sensibilidade para o diagnóstico de LTA, inclusive com possibilidade de identificar a espécie do parasita.

O quadro histopatológico típico da LTA é de uma dermatite granulomatosa difusa ulcerada, porém o diagnóstico de certeza só pode ser fornecido pelo encontro de formas amastigotas de Leishmania sp intra ou extracelulares.

Pacientes com leishmaniose cutânea difusa apresentam a intradermorreação da leishmania positiva, geralmente, exacerbada, podendo apresentar ulceração e necrose.

A imunofluorescência indireta é reagente em 70% dos pacientes com leishmaniose, porém falsos positivos podem ocorrer na doença de Chagas e no pênfigo foliáceo, por exemplo.

A pesquisa direta do parasito por meio do exame de esfregaço corado por Giemsa ou Leishman é o procedimento de primeira escolha nas lesões recentes.