O exame em campo escuro pode resultar positivo várias semanas antes da obtenção de um teste sorológico positivo e apresentar uma sensibilidade de 80% no diagnóstico das sífilis, sendo o método de escolha para a avaliação de lesões orais.

Por meio da microscopia de imuno-histoquímica, anticorpos antitreponemais ligados às espiroquetas presentes nos cortes tecidos são detectados após uma série de reações imunológicas, sendo necessário, para isso, o uso de microscópio de fluorescência.

Os testes sorológicos não treponêmicos são empregados na triagem da doença, bem como no monitoramento de seu curso após o tratamento. Os testes padrão incluem lâmina de reagina VDRL, cartão circular de reagina plasmática rápida (RPR), reagina sérica não aquecida (USR) e o teste de aglutinação com vermelho de toluidina (TRUST).

O ensaio imunoenzimático ligado à enzima (ELISA) foi aprovado recentemente pela FDA para uso, sendo considerado um teste de alta sensibilidade e especificidade, com a vantagem de ser automatizado e padronizado, baseado na floculação como ponto final.

Anticorpos específicos para treponemas são formados na sífilis primária e são detectados com alta sensibilidade por testes como o FTA-ABS e o MHA-TP. Normalmente, há uma tendência à reversão para soronegatividade após o tratamento, para a maioria dos pacientes.