A prova reversa consiste na pesquisa do anticorpo no soro do paciente e deve ser realizada com hemácias conhecidas – A e B.

A presença de autoaglutinina fria na amostra e a de anticorpo irregular no plasma ou soro comprometem os resultados obtidos na prova reversa.

A determinação do grupo ABO em recém-nascidos deve ser realizada por meio da prova direta, visto que anticorpos naturais nesse momento ainda não são detectáveis.

Na prova direta, a presença de Rouleaux pode tornar as reações fortemente negativas na determinação ABO; ocorre em macroglobulinemias, mielomas e hiperfibrinemias.

Na prova direta, soros-teste conhecidos (anti-A, anti-B e anti-AB) são colocados em contato com hemácias do paciente a ser testado, a fim de identificar a presença ou não dos antígenos A e B.