A guanilatoquinase das células humanas fosforila o aciclovir cinco vezes, para transformá-lo em difosfato e trifosfato de aciclovir.

Apresenta baixa afinidade pela timidinaquinase do HSV-1, HSV-2 e VZV, que fosforila esse medicamento, molécula ativa, transformando-o em difosfato de aciclovir.

O trifosfato de aciclovir é irreversivelmente incorporado ao DNA viral, inibe a DNA-polimerase viral e bloqueia a síntese de DNA viral.

A ação do aciclovir contra o HSV-1 é inferior em relação ao HSV-2 e a meia-vida plasmática do aciclovir é 6 horas, em adultos.

O aciclovir é completamente absorvido, com biodisponibilidade oral de 65%, penetrando bem na maior parte dos órgãos.