As micobactérias consistem em bacilos álcool-ácidos resistentes (BAAR) por resistirem à descoloração com etanol acidificado pela metodologia tradicionalmente denominada baciloscopia.

Sobre os detalhes técnicos para a metodologia citada quando aplicada para espécime clínico do tipo escarro espontâneo e de forma direta, analise as seguintes afirmativas.

I. O número mínimo de BAAR necessário para produzir um esfregaço com resultado positivo é estimado entre 100 a 1000 por mililitro (probabilidade de 50% de resultado positivo).

II. A Secretaria de Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde recomenda, para o preparo do esfregaço, o uso de Bico de Bunsen ou Cabine de Segurança Biológica, de luvas e de outros Equipamentos de Proteção Individual, em área exclusiva apropriada, sem circulação de pessoas, sem correntes de ar, e com exaustor contendo renovação do ar (seis a 10 renovações por hora).

III. A técnica mundialmente utilizada consiste na coloração do esfregaço pelo método de Ziehl-Neelsen sob metodologia padronizada e observação em microscopia de campo claro com uso de óleo mineral e aumento total de 100X.

Assinale:

A técnica de citometria de fluxo vem sendo aplicada na avaliação da susceptibilidade a antimicrobianos em micobactérias com resultados mais rápidos do que métodos tradicionais. Sobre o tema, analise as afirmativas a seguir.

I. Determinação da concentração mínima inibitória de antimicrobianos para cepas clínicas de Mycobacterium tuberculosis em até 24h.

II. Detecção da susceptibilidade ou da resistência a antimicrobianos de cepas clínicas Mycobacterium tuberculosis sem a multiplicação do microrganismo.

III. Determinação da concentração mínima inibitória de antimicrobianos para patógenos localizadas no interior de células fagocíticas.

Assinale:

Segundo as recomendações da Secretaria de Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde, após a detecção de bacilos álcool-ácido resistentes em cultura, métodos fenotípicos convencionais devem ser empregados seguindo um algoritmo específico para identificação presuntiva de micobactérias. Sobre os procedimentos recomendados, assinale a alternativa correta.

Bownds e colaboradores (1996) realizaram um dos estudos pioneiros sobre o uso da citometria de fluxo em testes de susceptibilidade a antimicrobianos. Tais pesquisadores usaram a cepa Mycobacterium fortuitum ATCC 14467 e o corante diacetato de fluoresceína (FDA) nos ensaios com antimicrobianos para determinar a concentração mínima inibitória. Na primeira parte do ensaio, os autores avaliaram o padrão de interação do corante com a cepa micobacteriana (viável ou inativada pelo calor) e com o meio de cultura, o qual poderia levar à interpretação errônea dos resultados quanto à fluorescência. Após a incubação, um volume de 10ml de FDA (10 mg/ml; Sigma) foi adicionado às soluções de meio de cultura com células cultivadas por sete dias a 37°C de M. fortuitum ou ao controle negativo de forma a obter uma concentração final de 100 ng/ml.

As suspensões foram incubadas a 37°C por 30 min e analisadas a 488nm com FACScam flow cytometer (Becton Dickinson Immunocytometry Systems) utilizando FAC Scan Lysys II software para a acquisição de dados e análise. Os gráficos resultantes estão na figura abaixo.



Legenda da Figura: Os números nos eixos y e x de cada painel são 100 , 101 , 102 , 103 e 104 , respectivamente.

Usando seus conhecimentos de citometria de fluxo e micobacteriologia laboratorial, assinale a alternativa correta.

Considerando os resultados em testes fenotípicos convencionais utilizados na identificação de micobactérias, indique a alternativa incorreta.

A cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) dos ésteres de ácido micólicos demonstrou rapidez e acurácia na identificação de várias espécies de Mycobacterium. Sobre os princípios padronizados e o conhecimento prévio da técnica, analise as afirmativas a seguir.

I. As espécies M. tuberculosis e M. bovis apresentam padrões indistinguíveis.

II. No processo de análise por HPLC, os ésteres de ácidos micólicos são separados em coluna de fase reversa através de gradiente, e detectados por espectrometria UV.

III. Um extrato preparado a partir de cultura com M. fortuitum ATCC 6841 é recomendado para utilização como controle positivo e serve como padrão de referência para nomeação de picos obtidos na análise por espectrometria.

Assinale:

Os ácidos micólicos presentes na parede celular de micobactérias são dispostos de maneira a formar uma membrana externa com alta hidrofobicidade, garantindo a esses microrganismos a resistência a diversos antimicrobianos e a álcool-ácido resistência. Com base na estrutura molecular desses compostos, os ácidos micólicos apresentam uma variação entre:

Vários sistemas foram descritos para identificação genotípica de cepas micobacterianas isoladas de espécimes clínicos, incluindo as diferentes espécies do complexo M. tuberculosis. Sobre os princípios e as aplicações dos sistemas para a identificação de micobactérias, analise as afirmativas a seguir.

I. As técnicas baseadas apenas em reação de polimerização em cadeia com iniciadores específicos para as deleções genômicas RD de M. tuberculosis como RD1, RD4, RD9, RD12, discriminam as espécies M. tuberculosis e M. bovis (incluindo a espécie M. bovis BCG) bem como outras espécies do complexo.

II. Espécies do complexo M. tuberculosis podem ser diferenciadas pelo teste AccuProbe (GenProbe Inc., San Diego, California, EUA), que consiste em sondas marcadas com éster de acridina. Esse mesmo sistema pode também ser aplicado na identificação de cepas do complexo M. avium e M. kansasii.

III. Os sistemas INNO-LiPA Mycobacteria version 2 (Innogenetics, Ghent, Bélgica) GenoType Mycobacteria (Hain Lifescience, Nehren, Alemanha) consistem em hibridização reversa de produtos de reação de polimerização em cadeia biotinilados aos seus fragmentos complementares presentes em “tiras" de membrana. Ambos permitem a identificação molecular de acima de 10 espécies de micobactérias. Uma desvantagem do sistema é a impossibilidade de uso em cepas cultivadas em meios líquidos.

Assinale:

As atividades desenvolvidas em um laboratório de microbiologia expõem o trabalhador a uma variedade de riscos que estão associados aos materiais empregados e aos métodos utilizados. Visando minimizar ou eliminar os riscos, é essencial o estabelecimento de um programa de biossegurança para o laboratório. O laboratório, dependendo das atividades que desenvolve pode apresentar, em maior ou menor grau, quatro categorias de riscos. No processo de avaliação de risco para o trabalho com agentes biológicos, uma série de critérios deve ser considerada, sobre o tema, assinale a alternativa correta.

De maneira semelhante ao ocorrido recentemente com outros grupos bacterianos, o número de espécies novas descritas para as micobactérias de crescimento rápido (MCR) tem aumentado significativamente nas últimas décadas, dificultando uma classificação confiável em laboratórios de rotina. Em alguns casos, as novas espécies foram propostas com base um único isolamento ou em um número pequeno de cepas isoladas. Sobre os aspectos taxonômicos recentes de MCRs, analise as afirmativas a seguir.

I. Os estudos taxonômicos envolvendo a filogenia entre membros de MCR têm sido baseados na análise de sequências dos genes 16S rRNA, 23S rRNA, hsp65 e aquele codificante para RNA polimerase.

II. A técnica de hibridização DNA-DNA consiste na metodologia de maior acurácia na determinação de espécies de MCRs, apesar de ser laboriosa e atualmente realizada em centros de referência internacionais, justificando a busca de alternativas por diferentes laboratórios de pesquisa.

III. Os complexos taxonômicos descritos para MCRs consistem em (i) Grupo M. fortuitum, composto por M. fortuitum, M. peregrinum, M. mucogenicum e M. senegalense; (ii) Grupo M. chelonae-M. abscessus, composto pelas espécies M. chelonae, M. abscessus, M. bolletii, M. massiliense e M. immunogenum; e (iii) Grupo M. smegmatis, constituído por M. smegmatis, M. goodii e M. wolinskyi.

Assinale: