As bactérias são fixadas sobre uma lâmina, coradas com cristal de violeta, um corante que é precipitado com iodo, e, em seguida, o corante não ligado é removido com descorante à base de álcool etílico e água. Um contra corante vermelho, a safranina, é adicionado para corar as células descoradas. Esse processo leva aproximadamente 10 minutos.

Para as bactérias gram-negativas que se tornam roxas, o corante fica preso na camada grossa de peptidoglicano, que circunda a célula.

A coloração de Gram perde confiabilidade para as bactérias que estão desnutridas por longo tempo ou foram tratadas com antibiótico, devido à degradação dos peptidoglicanos.

As bactérias que não podem ser classificadas pela coloração de Gram são as micobactérias, que possuem um revestimento externo lipídico e são diferenciadas pela coloração álcool-acidose resistentes, e os micoplasmas que não possuem peptidoglicanos.