Os padrões internos devem ter propriedades químicas e físicas diferentes da molécula a ser quantificada, além de serem puros, ausentes na amostra e inertes em relação aos compostos presentes.

O padrão interno deve ser adicionado após a etapa de limpeza ou enriquecimento para evitar alterações na concentração do padrão durante o preparo da amostra.

Os padrões internos isotopicamente marcados corrigem erros relacionados a variações no processo de preparo da amostra, e no volume de injeção mas não corrigem as variações relacionadas a diferenças na ionização (efeito matriz).

Isótopos marcados do analito (isotopólogos) são os padrões internos ideais, pois possuem estrutura idêntica e diferem apenas na massa, garantindo eficiência de ionização e comportamento cromatográfico semelhantes.

Os padrões internos devem eluir em tempos de retenção distintos do analito para que a quantificação seja realizada de forma precisa e seletiva.