A cromatografia em fase gasosa é comumente utilizada acoplada ao espectrômetro de massas para deteção de metabólitos. Como muitos metabólitos possuem baixo ponto de ebulição, é necessária uma etapa de derivatização para diminuir a sua volatilidade e permitir que possam ser analisados por GC-MS.

Na cromatografia líquida de alta eficiência utilizando fase reversa, os analitos hidrofóbicos eluem primeiro da coluna cromatográfica, seguidos por compostos polares e muito hidrofílicos.

Para a separação de compostos apolares, tais como lipídeos, utiliza-se comumente a técnica de cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC), que é uma variação da antiga cromatografia de fase normal, que utilizava sílica como fase estacionária.

A utilização de espectrômetros de massas de alta resolução e acurácia tornou rotineira a análise direta de misturas de analitos sem uma etapa anterior de separação, uma vez que essa metodologia é rápida, de alta repetibilidade e com capacidade de identificar múltiplos isômeros em uma única análise.

A separação de um (ou mais) composto(s) de interesse de outros analitos presentes em matrizes complexas pode ser realizada por cromatografia multidimensional, em que uma ou mais etapas de separação cromatográfica diferentes são realizadas antes da análise por espectrometria de massas (offline), ou acopladas sequencialmente à deteção pelo espectrômetro de massas (online). Uma desvantagem da cromatografia multidimensional online é o maior tempo ocioso do espectrômetro de massas.