Quanto menor o tempo de fixação menor a formação de ligações cruzadas e, por isso, é preferível um menor tempo de fixação para o emprego de métodos imuno-histoquímicos, razão pela qual a fase pré-analítica é muito importante nesses métodos.

Enzimas, como tripsina e pepsina, constituem um método enzimático para recuperação antigênica.

O controle negativo da reação imuno-histoquímica pode ser realizado omitindo-se o anticorpo primário nas lâminas testadas.

O método da fosfatase alcalina-antifosfatase alcalina (APAAP) tem três aplicações principais, isto é, serve para marcar tecidos com altos níveis de peroxidase endógena, para dupla imunomarcação aliada à peroxidase e para imunomarcação de tipos celulares específicos que se beneficiam da cor vermelha resultante da atividade enzimática sobre o substrato.

De um modo geral, as considerações técnicas para o método peroxidase antiperoxidase (PAP) não se aplicam ao método da fosfatase alcalina-antifosfatase (APAAP).

O uso do método da fosfatase alcalina como segunda marcação tem a vantagem de evitar a reatividade cruzada, que pode ocorrer quando dois procedimentos de imunoperoxidase são utilizados em conjunto.

Dupla imunomarcação com o método de fosfatase alcalina pode produzir excelente contraste com uso do Fast red como cromógeno.

New fuchsin é um cromógeno que produz a cor vermelha e pode ser utilizado com o método da fosfatase alcalina.

Os sistemas de detecção, com base em polímeros, foram introduzidos há alguns anos, na prática imuno-histoquímica com o objetivo de simplificação das múltiplas etapas, produzindo protocolos mais curtos com a vantagem de melhorar a sensibilidade de detecção.

Uma grande vantagem dos sistemas poliméricos de detecção é que eles eliminam o problema da biotina endógena por evitar o anticorpo secundário biotinilado.